Projekt w programie OPUS Narodowego Centrum Nauki zatytułowany „Mechanizmy rozpoznawania RNA przez białko ProQ oraz rola tego białka w oddziaływaniach pomiędzy niekodującymi RNA a regulowanymi mRNA u bakterii Escherichia coli” (Nr. 2018/31/B/NZ1/02612)

Małe regulatorowe RNA bakterii (sRNA) uczestniczą w regulacji ekspresji genów poprzez oddziaływania z komplementarnymi sekwencjami w cząsteczkach informacyjnych RNA (mRNA). Prowadzi to do zmian w stabilności mRNA lub w dostępności mRNA dla rybosomu, a przez to do zmian w syntezie białek kodowanych przez regulowane mRNA. Regulatorowe RNA często współpracują z białkami wiążącymi RNA, które chronią je przed degradacją lub pomagają im w połączeniu się z regulowanymi mRNA [1,2]. Bardzo dobrze znanym przykładem jest białko opiekuńcze Hfq. Niedawno odkryto, że u bakterii posiadających białko Hfq z licznymi cząsteczkami RNA oddziałują także białka posiadające domenę FinO. Do białek z rodziny FinO należy m.in. białko ProQ, które występuje u bakterii Escherichia coli, Salmonella enterica, oraz innych bakterii ważnych dla zdrowia człowieka. Dotychczasowe badania stwierdziły, że białka ProQ oraz Hfq wiążą w większości odmienne cząsteczki RNA w komórkach E. coli i S. enterica. Głównym celem tego projektu było wyjaśnienie w jaki sposób białko ProQ z bakterii E. coli rozpoznaje właściwe sobie RNA, po to aby lepiej zrozumieć na czym polegają różnice w działaniu białek ProQ i Hfq.

Aby wyjaśnić w jaki sposób białko ProQ rozpoznaje cząsteczki RNA zbadaliśmy oddziaływania między nimi z dwóch stron: od strony RNA oraz od strony ProQ. Ten pierwszy zestaw badań pozwolił nam na ustalenie, że domena FinO białka ProQ rozpoznaje znajdujące się na 3ʹ końcach RNA Rho-niezależne terminatory transkrypcji, oraz na określenie cech elementów struktury dwuniciowej i jednoniciowej tych terminatorów, które są wymagane dla optymalnego wiązania ProQ. Ponadto odkryliśmy, że w cząsteczkach RNA wiązanych przez ProQ występują motywy sekwencji, których rolą jest zapobieganie wiązania białka Hfq. Zaproponowaliśmy, że ProQ i Hfq konkurują o wiązanie RNA, a dla właściwego rozpoznawania RNA przez ProQ ważne są zarówno elementy pozytywnie wpływające na wiązanie ProQ jak i elementy negatywnie wpływające na wiązanie Hfq [3]. W ramach drugiego zestawu badań wprowadziliśmy mutacje w domenie FinO białka ProQ i zbadaliśmy jak mocno osłabiają one wiązanie RNA. Pozwoliło to nam na wskazanie aminokwasów, które mają największe znaczenie dla wiązania RNA, co świadczy o tym, że stanowią one część miejsca wiązania RNA w białku ProQ [4]. Ponadto, porównaliśmy w jaki sposób białko ProQ rozpoznaje cząsteczki sRNA i kontrolowane przez nie mRNA, co pozwoliło nam na lepsze zrozumienie udziału ProQ w oddziaływaniach pomiędzy cząsteczkami RNA.

Wykonane przez nas badania, określające w jaki sposób białko ProQ z bakterii E. coli używa reszt aminokwasowych na swojej powierzchni do wiązania RNA oraz jakie elementy sekwencji i struktury tych RNA są przez to białko rozpoznawane, są ważne dla zrozumienia różnorodności funkcjonalnej białek z domeną FinO. Ponadto odkrycie motywów sekwencji RNA służących jako negatywne determinanty wiązania Hfq, oraz wskazanie odmiennego udziału białka ProQ niż Hfq w oddziaływaniach pomiędzy cząsteczkami RNA, służą do zrozumienia mechanizmów kompetycji pomiędzy tymi białkami o wiązanie RNA oraz do wyjaśnienia komplementarności ich funkcji biologicznych. Przeprowadzone badania zostały wykonane we współpracy z laboratoriami prof. Giseli Storz z Narodowych Instytutów Zdrowia oraz prof. Katherine Berry z Mount Holyoke College w Stanach Zjednoczonych.

Referencje

1. Olejniczak M, Storz G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers? Mol Microbiol. (2017) 104(6):905-915 Pubmed
2. Olejniczak M, Jiang X, Basczok MM, Storz G. KH domain proteins: Another family of bacterial RNA matchmakers? Mol Microbiol. (2022) 117(1):10-19 Pubmed
3. Stein EM, Kwiatkowska J, Basczok MM, Gravel CM, Berry KE, Olejniczak M. Determinants of RNA recognition by the FinO domain of the Escherichia coli ProQ protein. Nucleic Acids Res. (2020) 48(13):7502-7519 Pubmed
4. Stein EM, Wang S, Dailey KG, Gravel CM, Wang S, Olejniczak M, Berry KE. Biochemical and genetic dissection of the RNA-binding surface of the FinO domain of Escherichia coli ProQ. RNA. (2023) 29(11):1772-1791 Pubmed